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荧光酶免定量测定甲胎蛋白的临床评价

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荧光酶免定量测定甲胎蛋白的临床评价林英柳丽娟林秀珍【摘要】目的通过ELISA、FEIA和TRFIA三种方法定量测定甲胎蛋白的比较，重点评价生物梅里埃公司全自动荧光酶标免疫分析系统(VIDAS)测定甲胎蛋白的临床应用价值。方法将同一份混合血清分别用ELISA、FEIA和TRFIA法每天测定2次，连续测14d。计算比较批内变异系数和批间变异系数。将高、中、低值60份血清分别用上述三种方法进行检测，比较相关性。将同一份高值混合血清进行6倍比稀释后分别用ELISA、FEIA和TRFIA检测进行线性分析。结果FEIA测混合血清批内为CV3．4％，批问Cy4．9％。ELISA测混合血清批内CV为7．6％，批间CV9．1％。TRFIA测混合血清批内为CV2．3％，批间CV2．7％。FFIA法检测与ELISA、TRFIA法检测结果高度相关(r值分别为0．942和0．986)。ELISA、FEIA和TRFIA在各自的线性范围内线性良好。结论TRFIA变异系数最小，其次分别是FEIA和ELISA。三种方法高度相关，可供临床使用。【关键词】甲胎蛋白类；时间分辨荧光免疫测定；酶联免疫吸附测定甲胎蛋白(a—fetoprotein，AFP)自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义。AFP的动态变化能观察病情进展情况，若血清AFP≥500ng／ml，持续1个月以上，或AFP≥200ng／ml，持续8周以上，并能排除妊娠、活动性肝炎、生殖系统胚胎性肿瘤，即可诊断为原发性肝癌。因而检测肝癌和肝炎患者血清中的AFP可作为治疗效果和预后的评价指标。本组采用荧光酶免疫分析法(fluorescence enzyme immunoassay，FEIA)、酶联免疫吸附试验(enzyme—immunosorbent assay，ELIsA)检测法及时间分辨荧光免疫分析法(time resolved flu— orescence immunoassay，TRFIA)对76份血清进行AFP检测，并对数据进行分析比较，为这些方法在临床上应用提供可靠的实验数据。资料与方法1．标本来源：收集2002年11月～2003年2月该院住院或门诊患者血清76份(AFP为2．76～778．6ng／m1)。将其中16份血清混合后分装(用于精密度试验)，置于一20℃冰箱中保存，集中测试。2．仪器：全自动酶标仪(ELX一800)、全自动酶标洗板机(ELP一40)、全自动荧光酶免疫分析miniVIDAS、全自动时间分辨荧光免疫分析仪(wallacl235)。3．AFP检测试剂：郑州博赛生物工程有限责任公司生产的(ELISA)定量试剂盒、梅里埃生物有限公司生产的(FEIA)定量试剂盒、PE公司生产的hAFP(TRFIA)定量试剂盒。4．方法：将混合的中值血清分别用ELISA、FEIA、TRFIA法每天测定2次，连续测定14d，进行精密度分析。将60份收集血清分别用以上三种方法进行测定。ELISA法第一孔为空白，从第二孔开始依次加入5ng／ml、10ng／ml、20ng／ml、50ng／ ml、100ng／ml和200ng／ml标准品作标准曲线，每批实验均带标准曲线。FEIA法采用单点复孑L定标，配套质控品，定标后同一批号试剂的标准曲线有效时间为14d。TRFIA法严格按照仪器操作手册进行，采用复孔6点定标(0、1、10、100、500、1作者单位：福州市传染病医院检验科·经验交流·000IU／ml标准品)，用配套试剂测定质控品，数值在标定范围内。对上述三种方法实验结果进行相关性和精密度分析。取高值混合血清作6点倍比稀释，各复测3次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，与分别用上述三种方法实际测定值比较进行线性分析。结果1．相关性分析：分别用上述三种方法对60份血清标本进行AFP定量分析，结果表明，FEIA法检测与ELISA、TRFIA法检测结果高度相关(r值分别为0．942和0．986，差异无统计学意义，P>0．05)。2．精密度试验：采取批内和批间差异确定。用上述方法分别对同一混合血清进行精密度试验。连续测定20次，计算j，S，求批内CV值(见表1)。每日测2次，连续测14d。计算亍，S，求批问CV值。结果表明，FEIA的重复性较ELISA好，而TRFIA测定优于FEIA。3．线性分析：标本AFP含量在5～200ng／ml(ELISA)、0．6～480ng／ml(FEIA)、1．2～1200ng／ml(TRFIA)范围之内呈良好线性。讨论荧光酶免疫分析(FEIA)是以碱性磷酸酶(alkali phospha— tase，ALP)作为酶标记用酶，以反应管作为固相载体，以4一甲基伞型酮磷酸盐(4一MUP)为酶反应荧光基质，由于4-MUP在碱性磷酸酶的作用下分解，脱磷酸基团生成4一甲基伞酮，其在360am激光照射下，发出448nm荧光，最终根据荧光计数仪记录所产生的荧光强度计算所测物质的浓度。其中ALP和4一MUP的化学反应作为放大系统，故其灵敏度达到或超过放免水平口]。VIDAS全自动荧光酶免分析仪检测AFP是一种自动定量试验，并结合酶免疫夹心分析法和最后荧光检测法。体系中固相包被针(SPR)除了起到固相的作用，还是分析检测的移液装置，各种反应所需的试剂均是现成的，并且已经事先加在密封好的试剂条上，所有的分析步骤均在仪器中自动进行。各个反应仓独立工作，24h待机，操作简便，整个反应过程在试剂条上完成，无管道，避免交叉污染[2]。(下转第184页)·184·国际检验医学杂志2006年2月第27卷第2期IntJLabMed，February2006，V01．27，No,2表2白细胞分类警示者与镜检结果比较警示显示模式警示率(％)敏感度(％)≮纛产阳≮磊?值阴专磊尸值阳性似然比阴性似然比专雯亍(％)(％)(％)。”(％)IGBlastBlandVarLymNRBC或NRBC／RRBC2．71．33．42．58．389．588．961．966．722．262．589．284．088．683．365．466．776．550．025．088．297．175．093．981．12．398．224．065．831．330．170．120．420．38O．9374．489．175．685．471．1表2中的数据分析表明，白细胞分类各种警示的循证指标(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及准确度)各不相同。其中检测IG和Blast的敏感度较高，检测Blast和VarLym的特异性较好，检测Bland的阳性预测值较高，检测Blast及VarLym的阴性预测值较高，而检测Blast的阳性似然比最高，阴性似然比最低，但准确率最高。说明CELL—DYN3700血细胞分析仪对异常细胞的警示具有一定程度的可信性。虽然此前本组在对该台分析仪进行应用评价时，已将随机抽取的血样标本进行仪器与显微镜的同步检测，结果显示两种检测手段的相关性好[z]。但仪器不能正确识别异常细胞的属性和数量，给临床诊断和治疗造成困难。况且，CELL-DYN3700对几项异常指标的检测都具有一定的假阳性和假阴性。因此，CELL—DYN3700在检测异常血细胞分类时只能作为一个过筛工具，并不能完全代替显微镜检查。在实际工作中，除了仔细分析仪器测得的各项参数及血细胞分析仪提供的图形外，还应注意仪器的工作环境、工作状态及各种能影响仪器性能的环境因素。随着高科技联合检测技术和计算机的应用，血细胞分析仪的性能大大提高，仪器对异常细胞的识别能力增强，有的仪器几乎达到目视显微镜的分类水平[3]。虽然白细胞计数和分类的警示率约为25％左右，确实存在一定的劳动强度，但仍不能一味依赖仪器。对于结果有异常报警的标本，需按以下镜检复查标准进行复查：白细胞计数可以不进行显微镜复查，但白细胞分类必须推片、染色后行显微镜复查。只有这样，才能使更多的异常标本被检出，确保血液检验的质量，避免漏诊和误诊。参考文献1潘瑞彭，王鸿利，主编．血液学及血液学检验．北京：人民卫生出版社，1990．2艾红梅．CELL_DYN3700全自动血细胞分析仪的初步评价．世界医疗器械，2001，7(3)：65—66．3李顺义．应重视血常规检验中的形态学观察．中华医学检验杂志，1999，22(1)：22-23．(收稿13期：2005-03—26)(上接第182页)表1VIDAS和ELISA检测混合血清的批内和批间变异结果比较本文AFP检测结果表明，(1)FEIA和TRFIA、ELISA法之间差异无统计学意义(P>o．05)，相关性r值分别为0．986和0．942。FEIA变异系数大于TRFIA，小于ELISA。除此之外VIDAS全自动荧光酶标免疫测试仪的精密度优于ELISA。 miniVIDAS操作方法简便，做一次定标曲线至少稳定14d，不必每批试验做曲线。VIDAS加样后由仪器自动完成，比ELISA更简单快捷，减少交叉污染，尤其在HIV等传染病标本应用中更为理想。VIDAS全自动荧光酶标仪快速免疫反应，30min出结果，24h开机，急诊标本也可以随时进行检测，同时还可用于各种抗原、抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原等其他检验项目，一机多用，特别适用于中小型医院。(2)TRFIA法标准曲线稳定14d，线性范围、精密度优于FEIA，出报告时间约150min，无法用于急诊，适用于批量检测。(3)ELISA法比较经济，在基层单位应用较为广泛，但每批试验必须做标准曲线，人工操作影响因素较多。参考文献1李倩，高学慧，甘勇，等．电化学发光与酶联免疫检测血清甲胎蛋白的比较．中华检验医学杂志，2001，24(4)：243．2倪安平，朱晓春，王宝玺，等．全自动荧光酶免疫分析仪检测泌尿生殖道衣原体的评价．中华检验医学杂志，2001，24(3)：190-192．(收稿日期：2005—08—03)